ABSTRAKT

Intestinální enterokoky jsou v „nové“ legislativě pitné vody jedním ze dvou klíčových mikrobiologických indikátorů, které by měly ukazovat na fekální znečištění. Musejí se stanovovat vždy, a to i v kráceném či orientačním rozboru pitné vody. Celkem bylo z provozních vzorků upravených, tj. pitných vod (nikoli však z neupravovaných studen a vrtů, u nichž se předpokládá vyšší riziko fekálního znečištění) vyšetřeno 134 kmenů enterokoků (Enterococcus spp.) a 93 kmenů, které byly identifikovány jako doprovodná mikroflóra, resp. potenciálně falešně pozitivní kmeny. Nejčastěji zachyceným druhem enterokoka byl E. casseliflavus (31 %), následovaný E. faecium (25 %). Absolutně nejčastějším druhem, který nepatří mezi intestinální enterokoky, byl shledán Aerococcus viridans (n = 80), a to ještě zdaleka ne všechny získané kmeny přežily první pasáž. Nejmenší citlivost (tj. největší rezistence) k volnému chloru byla zjištěna u druhu E. hirae a také u již zmiňovaného A. viridans. Všechny kmeny byly dále testovány na konfirmačním žluč-eskulin-azidovém agaru (ŽEA test) po dvou, čtyřech a 24 hodinách inkubace a na aktivitu β-D-glukosidázy (GLD) v selektivním prostředí (médium Enterolert DW, IDEXX). Falešně negativní ŽEA test po dvou hodinách inkubace byl zaznamenán u 10 % enterokoků, falešně negativní výsledek u testů na GLD vykazovalo pouze 1 % kmenů enterokoků, ale dalších sedm kmenů (5,3 %) vykazovalo reakci slabou. Falešně pozitivní ŽEA test po dvou hodinách inkubace byl zaznamenán u 8 % kmenů doprovodné mikroflóry, falešně pozitivní test na GLD vykazovalo 14 % kmenů. Metoda dle normy ČSN EN ISO 7899-2 plně vyhovuje na stanovení intestinálních enterokoků v pitných vodách. Použití alternativních metod založených na detekci aktivity enzymu β-D-glukosidázy není zcela vhodné, protože se rozšiřuje skupina „intestinálních enterokoků“ na celý rod Enterococcus spp., a nález tak nemusí jednoznačně ukazovat na fekální znečištění.

ÚVOD

Stanovení intestinálních enterokoků se zdá být na první pohled jednoduché, ale i tak má svoje úskalí. Na jedné straně jsou intestinální enterokoky v „nové“ legislativě pitné vody jedním ze dvou klíčových mikrobiologických ukazatelů, které by měly ukazovat na fekální znečištění s nejvyšší mezní hodnotou (NMH), na druhé straně se o svoje „práva“ hlásí alternativní metody založené na detekci enterokoků na základě aktivity β-D-glukosidázy, kdy se cílová skupina rozšiřuje na všechny druhy enterokoků, tj. Enterococcus spp. O ekologii enterokoků zejména v pitných vodách se zatím ví velmi málo, což komplikuje interpretaci dosažených výsledků. Proto byla provedena tato studie a výsledky byly prezentovány na konferenci Vodárenská biologie 2025 [1]. Zde je publikována upravená a doplněná verze.

PŘEHLED PROBLEMATIKY

Intestinální (střevní) enterokoky jsou grampozitivní kulovité nebo vejčité bakterie uspořádané do párů nebo řetízků a patří do rodu Enterococcus (řád Lactobacillales, kmen Firmicutes). Díky molekulárně genetickým metodám v taxonomii se počet popsaných druhů enterokoků neustále zvyšuje, např. v roce 1995 bylo známo jen 19 druhů, v současné době je platně popsáno 60 druhů [2]. Díky již celkem rozšířené metodě MALDI-TOF lze jednotlivé druhy identifikovat a pokusit se podrobněji interpretovat získané výsledky. Např. ze 101 izolátů z různých povrchových, technologických a pitných vod byly identifikovány druhy E. faecalis (26,7 %), E. hirae 20,8 %, E. faecium (18,8 %), E. casseliflavus (15,8 %), E. durans (11,8 %), E. mundtii a E. moraviensis (oba 2,3 %) [3].

Intestinální enterokoky jsou považovány za indikátory fekálního znečištění a jejich význam se v posledních letech zvýšil – podle nové legislativy [4, 5] jde společně s Escherichia coli o klíčový ukazatel a musí se stanovovat v každém typu rozboru (kráceném i úplném). S tím souvisí nejen vyšší počet analyzovaných vzorků, ale i počet pozitivních záchytů, které je třeba dobře interpretovat.

Frekvence záchytu v pitných vodách za posledních pět let v České republice (ČR) dle dat SZÚ (Zpráva o kvalitě pitné vody) [6] jsou uvedeny v tab. 1. V současné době se enterokoky stanovují i v rámci kráceného rozboru pitné vody, počet analýz, a tudíž i počet pozitivních záchytů tak stoupá (v tab. 1 je vidět především výrazný rozdíl mezi lety 2023 a 2024). Vyšší počty zachycených enterokoků souvisejí zejména s vyšším počtem provedených testů. Jelikož se však stále jedná o relativně malá čísla, bude dobré tuto situaci nadále sledovat.

Tab. 1. Záchyt intestinálních enterokoků v pitných vodách v ČR (kategorie: > 5 000 zásobovaných obyvatel, < 5 000 zásobovaných obyvatel, celkový počet analyzovaných vzorků, počet pozitivních vzorků, aritmetický průměr ze všech výsledků a maximální hodnota) v letech 2020–2024 (KTJ = kolonie tvořící jednotky)
Tab. 1. Detection of intestinal enterococci in drinking water in the Czech Republic (categories: > 5 000 population supplied, < 5 000 population supplied, total number of samples analysed, number of positive samples, arithmetic mean and maximum value) in 2020–2024 (CFU = colony forming units)

Odborné literatury na téma intestinální enterokoky je opravdu mnoho, jde však převážně o studie popisující, odkud (z jakého zdroje) byly konkrétní druhy izolovány, nebo o popis a charakteristiku nových druhů. Pokud existují environmentální studie, jsou zaměřeny především na povrchové a koupací vody a dále na kaly či sedimenty. Výzkumy zabývající se hlubším průzkumem enterokoků izolovaných z pitných vod chybějí. Přestože tedy existuje řada studií [7, 8] na téma „kdo, kdy a odkud izoloval jakého enterokoka“, o vlastní ekologii se mnoho neví – a to zejména v souvislosti s pitnou vodou, úpravou pitné vody, přežíváním/množením se v biofilmech apod.

I když se všechny běžně identifikované druhy enterokoků vyskytují ve střevech člověka či teplokrevných živočichů, jsou vyčleněny druhy typicky fekální (E. faecium, E. faecalis, E. hirae, E. durans) a pak druhy, které bývají spojovány s možným pomnožením na rostlinném materiálu (E. mundtii, E. casseliflavus) [3]. Enterokoky jsou také často používaným ukazatelem při trasování mikrobiálního znečištění (Microbial Source Tracking – MST) a jsou popsány různé způsoby jejich eliminace z vodního prostředí. Také jsou považovány za významné přenašeče antibiotické rezistence (vankomycin, ampicilin). V prostředí se často vyskytují v nevirulentní formě VBNC (Viable But Not Culturable) kmenů.

Ke stanovení intestinálních enterokoků v pitných vodách se používá již léta osvědčená metoda dle ČSN EN ISO 7899-2 [9], která zahrnuje membránovou filtraci vzorků, kultivaci 48 hodin při 36 °C na agaru dle Slanetze a Bartleyové a konfirmaci dvě hodiny při 44 °C na žluč-eskulinovém agaru s azidem sodným (dále ŽEA). Za intestinální enterokoky se považují červeně až vínově zbarvené kolonie (obr. 1), jež po přeočkování na konfirmační médium vykazují zčernání média pod kolonií. Tato metoda by měla zachytit převážně druhy enterokoků fekálního původu (E. faecalis, E. faecium, E. durans a E. hirae). S tím také souvisí zkrácení doby konfirmace ze čtyř na dvě hodiny v roce 2001, kdy se předpokládalo, že typické fekální enterokoky mají rychlejší a intenzivnější aktivitu ŽEA testu. Novější metody, které mají ambici stát se alternativními, jsou často založeny na aktivitě enzymu β-D-glukosidázy, což zahrnuje detekci všech druhů enterokoků (Enterococcus spp.) [10]. To se nezdá být vhodné zejména proto, že nejde o indikátorový, nýbrž klíčový ukazatel s limitní hodnotou typu NMH. Naopak cesta pro lepší/podrobnější interpretaci výsledků stanovení enterokoků by měla vést zcela opačným směrem, tedy k identifikaci jednotlivých druhů.

Obr. 1 a, b. Vlevo: Aerococcus viridans, tvořící velmi drobné (většinou nečernající) kolonie; vpravo: detekce intestinálních enterokoků
Fig. 1 a, b. Left: Aerococcus viridans, forming very small (mostly non-blackening) colonies; right: detection of intestinal enterococci

METODIKA

Do této studie byly zahrnuty kmeny, které byly izolovány z upravených pitných vod (nikoli však studní), získané během dvou let z provozních hydroanalytických laboratoří. Kmeny byly přečištěny, identifikovány metodou MALDI-TOF (s aplikací kyseliny mravenčí) a zopakován byl konfirmační test s tím, že výsledky byly odečítány po dvou, čtyřech a 24 hodinách. Navíc byly kmeny testovány na aktivitu β-D-glukosidázy v selektivním prostředí (médium Enterolert DW firmy IDEXX, nově též dle ISO 7899-3 [11]).

V neposlední řadě byli zástupci nejčastěji izolovaných druhů testováni na citlivost k volnému chloru metodou, upravenou dle Přílohy 4 vyhlášky 409/2005 Sb. [12].
Do odměřeného objemu (1 000 ml) odstáté vodovodní vody o laboratorní teplotě byl přidán roztok chlornanu sodného tak, aby se obsah volného chloru pohyboval v rozmezí 0,15–0,17 mg/l. Poté se roztok uměle kontaminoval testovanými kmeny rodu Enterococcus. Výchozí počet KTJ testovacího kmene dosahoval hodnoty řádově 105 KTJ/ml. Před vlastní zkouškou byla kontaminovaná voda dokonale promíchána (např. protřepáním), aby se dosáhlo stejnoměrného rozptýlení mikroorganismů. Ve zkušebních intervalech jedna, pět a 30 minut se 0,5 ml takto připraveného vzorku roztoku naočkovalo na povrch pevného kultivačního média a po kultivaci po dobu 48 hodin při teplotě (36 ± 2) °C se spočítaly kolonie, jež vyrostly na jeho povrchu. Během zkušební doby se zkušební roztok v baňce neustále promíchával. Zároveň byla naočkována původní suspenze, aby se získal výchozí počet enterokoků. My jsme provedli stanovení ve všech uvedených časových intervalech, ale hodnotili jsme pouze výsledky po jedné minutě (po pěti a 30 minutách byly již výsledky převážně negativní). Vždy byl u každého druhu paralelně testován kmen izolovaný z upravené pitné vody a kmen izolovaný z volného prostředí (koupací voda) a vše bylo očkováno duplicitně. Po inkubaci byl spočítán relativní úbytek testovaného druhu (kmenu) po jedné minutě působení volného chloru oproti kontrolnímu stanovení.

VÝSLEDKY A DISKUZE

Identifikace druhů

Celkem bylo zpracováno 227 kmenů izolovaných v pěti vodohospodářských laboratořích z pitných (upravených) vod s tím, že 134 bylo následně identifikováno jako druhy patřící do rodu Enterococcus (celkem 10 druhů) a 93 náleželo mezi další rody (s naprostou převahou druhu Aerococcus viridans).

Druhové složení enterokoků a jejich poměrné rozdělení je uvedeno na obr. 2. Nejčastěji identifikovaným druhem byl E. casseliflavus (31 %), následoval E. faecium (25 %), E. hirae (13 %), E. faecalis (10 %) a E. mundtii (9 %). Druhy enterokoků, které jsou dle ČSN EN ISO 7899-2 [9] považovány za fekální (faecalis, faecium, hirae, durans), celkem tvořily pouze 54 %. Pro srovnání – naše dřívější nepublikované výsledky identifikace 612 enterokoků z koupacích vod ukázaly, že nejčastějším identifikovaným druhem byl E. faecium (25,2 %), následoval E. faecalis (21,1 %), E. durans (17,3 %) a E. casseliflavus (14,4 %). Takové soubory lze samozřejmě srovnávat jen omezeně, nicméně jak je z toho patrné, jiná matrice dává jiné výsledky (bohužel literatura citovaná v úvodu [3] analyzovala enterokoky ze „směsi matric“). Že jde v případě koupací vody o zcela jinou matrici, je zjevné i z typu doprovodné mikroflóry. Nejčastějším druhem, který rušil stanovení intestinálních enterokoků v koupacích vodách, byl podle našich dřívějších výsledků a též v citované literatuře [3] druh Lactobacillus plantarum, zatímco v pitných vodách byl nejrozšířenějším druhem doprovodné mikroflóry Aerococcus viridans.

Obr. 2. Zastoupení jednotlivých druhů intestinálních enterokoků izolovaných z pitných vod
Fig. 2. Occurrence of individual species of intestinal enterococci isolated from drinking water

Nejvyšší výskyt druhu E. casseliflavus v pitné vodě zatím neumíme dobře interpretovat, je však nutno zmínit, že nebylo izolováno „hodně kmenů z jednoho vzorku“, jak tomu bývá často u vod koupacích, ale většinou šlo o průběžný výskyt. I v dříve uvedených publikacích se tento druh mnohdy spojuje s možným pomnožením na rostlinném materiálu. V pitné vodě jde především o to, jak se „chová“ např. v biofilmech či na pískových filtrech (což nevíme). Avšak na rozdíl od vzorků koupacích vod, kdy může dojít k pomnožení tohoto druhu třeba na rákosí a membránový filtr je pak plný těchto (spíše drobnějších) kolonií, zde se většinou o přerostlé filtry nejednalo. Pokud byl membránový filtr plný drobných kolonií, šlo výhradně o A. viridans).

Konfirmační a doplňující testy

V tab. 2 jsou uvedeny výsledky stanovení konfirmačních a doplňkových testů u jednotlivých druhů. Kromě absolutního počtu pozitivních reakcí u kmenů jednotlivých druhů je uveden relativní podíl falešně pozitivních (u doprovodné mikroflóry) a falešně negativních testů (u enterokoků).

Doba provádění ŽEA testu je podle stávající verze normy ČSN EN ISO 7899-2 [9] dvě hodiny, což bylo také bráno jako referenční čas. Další časy (původně použí­vané čtyři hodiny a 24 hodin) byly testovány pro případnou diskuzi výsledků. Rozdíl mezi dvěma a čtyřmi hodinami byl však minimální. Falešně negativní ŽEA test (tedy po dvou hodinách inkubace) byl zaznamenán u 10 % enterokoků, nejvíce u druhů E. gallinarum, E. casseliflavus a E. durans. Falešně negativní výsledek u testů na β-D-glukosidázu vykazovalo pouze 1 % kmenů enterokoků, ale dalších sedm kmenů (5,3 %) vykazovalo reakci slabou. Není bohužel přesně známo, jak má pozitivní test na GLD vypadat, protože u Enterolert DW testu není dostupný žádný komparátor. Falešně pozitivní ŽEA test (po dvou hodinách inkubace) byl zaznamenán u 8 % kmenů doprovodné mikroflóry, u některých kmenů A. viridans pozitivní reakce během následných 20 hodin „vybledla“. Falešně pozitivní test na β-D-glukosidázu vykazovalo 14 % kmenů.

Citlivost enterokoků k volnému chloru

Nejčastěji izolované druhy enterokoků a nejčastější doprovodný druh A. viridans byly vybrány k testování na citlivost k volnému chloru. Traduje se, že enterokoky jsou méně citlivé k působení volného chloru než třeba koliformní bakterie, a i výsledky našeho provozního testování dezinfekčních činidel to potvrzují (komerční, nepublikované výsledky). Vždy byly testovány dva kmeny od jednoho druhu (u E. faecalis tři kmeny) s tím, že jeden kmen byl pokaždé izolován z upravené pitné vody (a dá se předpokládat, že se mohl s volným chlorem setkat) a druhý z typicky přírodního prostředí (koupací vody). Legislativně [12] jsou dány požadavky, aby počty enterokoků byly sníženy minimálně o tři řády, a to v koncentraci volného chloru 0,3 mg/l [12]. Naše studované kmeny toto víceméně splnily i při poloviční koncentraci volného chloru (0,15 mg/l). Výsledky jsou demonstrovány na obr. 3. Nejméně citlivé druhy byly E. hirae, A. viridans a kmen E. mundtii, který byl izolován z pitné (nikoli z koupací) vody. Naopak nejcitlivější druh byl E. durans. U 25 % kmenů druhu E. durans byla zaznamenána zpožděná reakce ŽEA testu (tab. 2), což by mohlo být způsobeno stresem kmenů z upravené vody. Určitá rezistence k volnému chloru u druhu E. hirae mohla způsobit, že se tento druh vyhoupl na třetí místo mezi identifikovanými kmeny, a taktéž určitá rezistence druhu A. viridans může vysvětlit jeho častý výskyt ve formě doprovodné mikroflóry. Nejvíce rezistentní kmen E. hirae je rovněž předepsán pro testování baktericidních vlastností dezinfek­čních prostředků [13]. Až do posledního provedeného experimentu se zdálo, že přírodní kmeny mají vyšší citlivost k působení volného chloru (nejsou stresované?) než kmeny izolované z pitné vody, což se však absolutně nepotvrdilo u druhu E. mundtii, kde to bylo přesně naopak.

Tab. 2. Výsledky doplňkových testů u kmenů jednotlivých druhů; je uveden počet vyšetřených kmenů (n), pozitivní výsledky ŽEA testu po dvou, čtyřech a 24 hodinách, pozitivní výsledky u testu na β-D-glukosidázu (GLD). Zvlášť jsou uvedeny falešné výsledky (falešně pozitivní u doprovodné mikroflóry či falešně negativní u enterokoků) u testů ŽEA po dvou hodinách a GLD v %
Tab. 2. Results of additional tests for strains of individual species; the number of strains examined (n), positive results of the BEA test after 2, 4 and 24 hours, positive results of the β-D-glucosidase (GLD) test. False results (false positives for background microflora or false negatives for enterococci) for BEA tests after 2 hours and GLD  are given separately [%]

ZÁVĚR

Ačkoli „sběr enterokoků“ trval minimálně dva roky, počet získaných kmenů není nikterak vysoký (enterokoky = 134 + doprovodná mikroflóra = 93). I tak byly ale získány cenné údaje. Nejčastěji izolovaným druhem z pitných vod byl E. casseliflavus, jenž bývá v přírodních vodách zastoupen méně a spíše nárazově. Tento výskyt zatím neumíme zcela interpretovat, nabízí se možnost jeho schopnosti přežívání v biofilmu (?). Tento druh bývá také spojován s možností pomnožení na rostlinném materiálu. Z doprovodné mikroflóry byl nejčastěji identifikován druh A. viridans, který má spolu s E. hirae zároveň nejmenší citlivost k volnému chloru. Metoda dle normy ČSN EN ISO 7899-2 plně vyhovuje na stanovení intestinálních enterokoků v pitných vodách. Používání alternativních metod založených na stanovení aktivity enzymu GLD není zcela vhodné, jelikož rozšiřuje skupinu „intestinálních enterokoků“ na stanovení Enterococcus spp., čímž rozšiřuje detekovanou skupinu i o druhy s ne zcela jasným fekálním původem. Navíc k hodnocení výsledků enterokoků se více hodí zcela opačný trend – identifikace kmenů a interpretace jejich výskytu v prostředí. Kromě toho nejčastěji detekovaný druh A. viridans, jenž patří mezi doprovodnou mikroflóru, vykazuje falešně pozitivní výsledky GLD v 15 %. Vzhledem k tomu, že jde o klíčový ukazatel s nejvyšší mezní hodnotou (NMH), by takové rozšíření „skupiny“ mohlo způsobit komplikace.

Poděkování

Vznik této publikace byl podpořen v rámci MZ ČR – RVO (Státní zdravotní ústav – SZÚ, IČ 75010330). Zvláštní poděkování patří pracovníkům laboratoří provozovatelů vodovodů, kteří nám zaslali kmeny ke studiu.

Příspěvek prošel recenzním řízením.