This article is available in Czech only. For translation or more information on this topic, please contact author.

 

Souhrn

Epidemiologie odpadních vod byla navržena v roce 2001 ke sledování koncentrace nelegálních drog a jejich metabolitů v odpadních vodách přitékajících do komunálních čistíren odpadních vod, do kterých se zmíněné sloučeniny dostávají z moče konzumentů drog cestou kanalizační sítě. Poprvé byla použita v roce 2005 ke sledování kokainu v Itálii. Postupně byl přístup aplikován na sledování dalších nezákonných drog jako např. heroin, kanabis nebo stimulantů na bázi amfetaminu. Analýza odpadních vod je velmi slibný způsob k monitorování legálních stimulantů, jako je nikotin a jeho metabolity a alkohol, resp. metabolity alkoholu. Ve VÚV TGM, v. v. i., je od roku 2012 rozvíjena metoda LC-MS umožňující současné stanovení řady těchto látek. Příspěvek shrnuje analytické možnosti stanovení a metodiku vyvinutou na pracovišti se zaměřením na analyty nikotin a jeho metabolity a na metabolit alkoholu ethylsulfát, nově doplněné v rámci řešení projektu „Čistá voda – zdravé město: Komunální odpadní voda jako diagnostické médium hlavního města Prahy“ v rámci Konceptu IV.

Úvod

Epidemiologie odpadních vod byla navržena v roce 2001 [1] ke sledování koncentrace nelegálních drog a jejich metabolitů v odpadních vodách přitékajících do komunálních čistíren odpadních vod, do kterých se zmíněné sloučeniny dostávají z moče konzumentů drog cestou kanalizační sítě. Poprvé byla použita v roce 2005 ke sledování kokainu v Itálii [2]. Postupně byl přístup aplikován na sledování dalších nezákonných drog jako např. heroin, kanabis nebo stimulantů na bázi amfetaminu [3–6]. V České republice proběhlo např. sledování v rámci projektu Dragon (projekt Ministerstva vnitra, VG20122015101 Stanovení množství nelegálních drog a jejich metabolitů v komunálních odpadních vodách – nový nástroj pro doplnění údajů o spotřebě drog v České republice) [7]. Sledovány byly metamphetaminy, kokain a jeho metabolity, opioidy, LSD, buprenorfin, metadon a jeho metabolit EDDP, efedrin, tramadol a nor-THC s využitím dříve vyvinuté metodiky [8].

V rámci řešení projektu „Čistá voda – zdravé město: Komunální odpadní voda jako diagnostické médium hlavního města Prahy“ (dále jen Projekt) byly analyzovány možnosti rozšíření stávající metodiky o další zneužívané látky. Na základě literatury a dřívějších prací byly vybrány nikotin a jeho metabolity, metabolit alkoholu ethylsulfát a kathinony (nové syntetické drogy).

Analýza odpadních vod je velmi slibný způsob k monitorování legálních stimulantů, jako je nikotin a jeho metabolity. Avšak koncentrace těchto látek značně kolísá v průběhu roku a často dosahuje velmi nízkých hodnot. Je to způsobeno hlavně nestabilitou nikotinu v odpadní vodě. Proto se sledují hlavně stabilní metabolity – kotinin a trans-3´-hydroxykotinin. V lidském těle je nikotin metabolizován na kotinin (70–80 %) a nikotin-N´-oxid (4–7 %). Kotinin je potom dále metabolizován na další submetabolity, tj. jenom 10–15 % zkonzumovaného nikotinu je vyloučeno jako kotinin [9]. Část nikotinu přechází do moči nemetabolizována. Nikotin se ale může dostávat do odpadní vody nejen s močí, ale i oplachem z nedopalků cigaret a popela [10, 11]. Dalším zdrojem nikotinu je substituční léčba (nikotinové náplasti a žvýkačky) a elektronické cigarety [11]. Analýza nikotinu v odpadní vodě není specifická a nevystihuje nebezpečnou konzumaci tabáku. Proto se pro kvantifikaci nikotinu v některých studiích využívají např. alkaloidy anabasin a anatabin, které jsou specifické pro sušený tabák, a stanovují se spolu s nikotinem a kotininem jako biomarkery pro konzumaci tabáku v odpadní vodě [12].

Obr. 1. Zapojení se šesticetným ventilem, eluce proti směru SPE
Fig. 1. Conection of six-way valve, elution against the direction of SPE

Alkoholické nápoje jsou jednou z nejpopulárnějších látek ve společnosti s obsahem psychoaktivní sloučeniny ethanol. Ethanol je v játrech oxidován především na acetaldehyd (90–95 %). Malá část (< 0,1 %) přechází na metabolity ethylsulfát (EtS) a ethylglukuronid [13]. Ethylglukuronid není vhodný jako biomarker v odpadních vodách, protože je v nich velmi nestabilní [14]. Ethylsulfát je specifický biomarker pro monitorování spotřeby alkoholu. Jedná se o metabolit ethanolu, který indikuje nedávnou konzumaci alkoholu s dobou detekce do 48 hodin u zdravých jedinců a je stabilní v odpadní vodě [14].

Ke stanovení nikotinu a jeho metabolitů se nejvíce používají přístroje LC-MS/MS [9, 11, 12, 15–20], výjimečně LC-QTOF [21] nebo hybridní MS Q-Exactive s vysokým rozlišením [22–25]. Detekce a kvantifikace se provádí s hmotnostním detektorem typu trojitého kvadrupolu s ionizací v pozitivním módu ESI+. Odpadní vody jako složitá matrice obsahují velké množství koeluujících sloučenin, které mohou ve velké míře ovlivňovat ionizaci sledovaných sloučenin. Proto se před extrakcí přidávají ke vzorku odpadní vody deuterované izomery stanovovaných analytů a kvantifikace se provádí metodou interního standardu [9–12, 15–28]. Ke zvýšení citlivosti stanovení a čištění se používá prekoncentrace vzorku extrakcí na pevné fázi (SPE) v zapojení on-line [25–27] nebo off-line [9, 11, 15–24, 28]. Používají se kolonky Oasis HLB [11, 14, 19–21, 26–28], Oasis MCX [15], StrataX [12]. Pro on-line SPE se používá zejména kolonka Hypersil Gold [23–25]. Stanovení nikotinu a jeho metabolitů se provádí většinou s kolonami s reverzní fází C18 [9–12, 15–28] a středně polární mobilní fází, která obsahuje organickou fázi (nejčastěji acetonitril nebo methanol) a vodnou fázi (voda s přídavkem mravenčanu nebo octanu amonného v proměnlivém poměru podle nastaveného programu gradientu).

Tabulka 1. Přehled analytů, jejich základní charakteristiky a rozdělení do metod stanovení
Table 1. Overview of analytes, theirs characteristics and methods of detection

Ke stanovení ethylsulfátu v odpadní vodě se používá metoda kapalinové chromatografie s hmotnostním detektorem s trojitým kvadrupolem a elektrosprejem jako iontovým zdrojem v negativním módu (ESI-) [13, 29–35]. EtS je polární sloučenina a na tradičních kolonách C18, C8 s reverzní fází je málo zadržován. Proto se rozšířilo jeho stanovení pomocí iontově párové chromatografie. Používají se iontově párová činidla: 5 mM dibutylamonium acetát [24], 7 mM dihexylamonium acetát [12, 25]. Používané mobilní fáze jsou voda a methanol, iontově párové činidlo se přidává do jedné nebo obou fází. Úspěšně byla ke stanovení EtS použita kolona Synergi Polar-RP (polar endcaped phenylpropyl reverzní fáze) [31, 32]. K eluci se používá voda s 0,1 % kyselinou mravenčí a acetonitril. Ke zlepšení ionizace se za kolonu přidává acetonitril. V poslední době se vyrábějí inertní kolony s navázaným trifunkčním alkylovým ligandem C18, který podporuje retenci polárních sloučenin a eliminuje potřebu přídavku iontových párů [27, 33, 34]. Jsou to např. kolony: Atlantis T3 nebo Chrompack Inertsil ODS-3 (Varian). Používají se s mobilními fázemi voda s 0,1 % kyselinou mravenčí a acetonitrilem a s post column přídavkem acetonitrilu ke zvýšení ionizace.

Obr. 2. Ukázka kalibrační křivky pro metamfetamin (MAMP)
Fig. 2. Example of calibration curve (methamphetamine)
Obr. 3. Ukázka kalibrační křivky pro kotinin (COT)
Fig. 3. Example of calibration curve (cotinine)
Obr. 4. Ukázka chromatogramu extrahovaných iontů v režimu ESI+ (amfetamin, benzoylecgonin, buprenorphin, EDDP, efedrin, extáze, fentanyl, heroin, kokaethylen, kokain, LSD, metadon, metamfetamin, morfin, nor-diazepam, nor-fentanyl, tramadol)
Fig. 4. Example of extracted ion chromatograms in ESI+ (amphetamine, benzoylecgonine, buprenorphine, EDDP, ephedrine, MDMA, fentanyl, heroin, cocaethylene, cocaine, LSD, methadone, methamphetamine, morphine, nor-diazepam, nor-fentanyl, tramadol)
Obr. 5. Ukázka chromatogramu extrahovaných iontů v režimu ESI+ (ethylcathinon, mefedron, 4-methylethcathinon, metylon, nor-mefedron, pentedron, tramadol, trans-3-hydroxykotinin, α-pyrrolidinovalerofenon)
Fig. 5. Example of extracted ion chromatograms in ESI+ (ethylcathinone, mephedrone, 4-methylethcathinone, metylone, nor-mephedrone, pentedrone, tramadol, trans-3-hydroxykotinin, α-pyrrolidinovalerofenone)
Obr. 6. Ukázka chromatogramu extrahovaných iontů v režimu ESI+ (nikotin, kotinin a trans-3-hydroxykotinin)
Fig. 6. Example of extracted ion chromatograms in ESI+ (nicotine, cotinine and trans-3-hydroxycotinine)

Stanovení ethylsulfátu se dá provádět i s HILIC kolonami, např. SeQuant ZIC-HILIC (Merck) a mobilními fázemi 5 mM octan amonný (pH 6,8) a acetonitril [33].

Metodika

Postupně bylo v závislosti na chemických vlastnostech a možnostech stanovení jednotlivých látek zavedeno stanovení tří desítek látek metodou kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí za podmínek ionizace elektrosprejem v pozitivním a negativním módu. Přehled stanovovaných analytů včetně jejich základní charakteristiky a rozdělení do postupů stanovení je uveden v tabulce 1.

Použitá technika: kapalinový chromatograf Agilent 1200 RR s binárním čerpadlem, hmotnostní detektor Applied Biosystem 4000 Q Trap s trojitým kvadrupólem, autosampler Aspec GX-271 (Gilson). Stanovení všech látek bylo prováděno s chromatografickou kololnou Synergi Hydro-RP80A (150 × 2,0 mm, 4 µm).

Multireziduální stanovení této skupiny analytů se nedalo provést vzhledem k jejich odlišným chemickým vlastnostem a koncentračním hladinám jejich výskytu. Z tohoto důvodu bylo stanovení rozděleno do čtyř separátních postupů.

Analýzy byly prováděny v odpadní vodě odebírané v nátoku na čistírnu komunálních odpadních vod. Tato voda je velmi komplexní matrice a jako nezbytné se jeví použití vnitřních standardů. Matrice silně ovlivňuje ionizaci. Bylo pozorováno potlačení ionizace vlivem látek přítomných ve vzorku. Proto bylo pracováno s deuterovanými standardy všech stanovovaných látek.

Pro analýzy se zpracovávají 24hodinové kompozitní vzorky odebírané na nátoku na čistírnu komunálních odpadních vod, které se po odběru uchovávají v chladu a temnu. Pokud nelze vzorek analyzovat do 72 hodin od odběru, vzorek se zmrazí a do vlastní analýzy se skladuje při teplotě -20 ± 4 °C.

Před vlastním stanovením se vzorky odstředí a ze vzorku se odstraní pevné částice filtrací přes jednorázové membránové filtry o porozitě 0,45 µm. Po přídavku směsného roztoku vnitřních standardů je vzorek připraven k LC-MS/MS analýze. Před chromatogrfickou analýzou se vzorky zakoncentrují z objemu 1–5 ml on-line SPE (drogy, nikotin a jeho metabolity). K on-line prekoncentraci vzorků byl použit autosampler Aspec GX-271(Gilson) a kolonka Hypersil Gold (20 × 2,1 mm, 12 µm), na kterou bylo 1–5 ml vzorku vloženo průtokem 0,5 ml/min. Potom byla kolonka ještě promyta 1 ml UHQ vody, aby se dokončil transfer vzorku a odstranily některé interference. Eluce analytů na chromatografickou kolonu byla prováděna mobilní fází jejím průtokem koncentrační kolonkou v protisměru v zapojení podle obr. 1. Pouze analýza ethylsulfátu se vzhledem k jeho vysokým koncentracím (desítky µg/l) provádí bez prekoncentrace s nástřikem 5 µl vzorku na kolonu.

Všechny používané chemikálie jsou čistoty p. a. nebo vyšší. Pro kalibraci jsou používány certifikované referenční chemikálie, např. fy Merc, Lipomed, Chromservis. Jako vnitřní standardy jsou používány deuterované látky, také certifikované. Podmínky kapalinové chromatografie pro jednotlivé postupy shrnuje tabulka 2.

Tabulka 2. Podmínky kapalinové chromatografie
Table 2. Liquide chromatography settings

Identifikace a kvantifikace se ve všech případech provádí za pomoci vyhodnocovacího systému Analyst® Software. Jednotlivé látky se identifikují porovnáním retenčních časů s retenčními časy standardů a shodnosti poměru intenzit dvou sledovaných přechodů dané látky ve vzorku a v kalibračním roztoku. Kvantifikace se provádí na základě hodnot vypočtených pomocí kalibračních křivek metodou kalibrace na vnitřní standard (deuterovaný standard). Ve stanovovaném rozsahu byly všechny kalibrační křivky lineární (korelační koeficient 0,99 a lepší).

Pro ukázku jsou na obr. 2–8 uvedeny kalibrační křivky a chromatogramy extrahovaných iontů standardů. Je zobrazen prekurzorový, produktový ion a vnitřní standard.

Meze stanovitelnosti (LOQ) dosažené popsanými postupy v matrici odpadní voda jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3. Meze stanovitelnosti (LOQ) v matrici odpadní voda
Table 3. Limits of quantification for wastewater

Podrobněji jsou použité analytické metody pro stanovení nikotinu a jeho metabolitů a ethylsulfátu popsány ve sborníku z konference Hydroanalytika 2019 [36].

Obr. 7. Ukázka chromatogramu extrahovaných iontů v režimu ESI- (nor-THC)
Fig. 7. Example of extracted ion chromatograms in ESI- (nor-THC)
Obr. 8. Ukázka chromatogramu extrahovaných iontů v režimu ESI- (ethylsulfát)
Fig. 8. Example of extracted ion chromatograms in ESI- (ethylsulfate)

Pro skupinu syntetických kathinonů byly hledány možnosti snížení mezí stanovitelnosti, protože nebyl zaznamenán pozitivní nález těchto látek (s výjimkou dvou hodnot mefedronu těsně na úrovni LOQ, období hodnocení 2018). Zkoušená metodika vycházela z dřívější metodiky off-line SPE vyvinuté v projektu Program IGA 2013 – Projekt „Nové drogy – analýza trhu epidemiologie užívání a identifikace možnosti pro snižování škod“ [37]. Ani při zpracování 500 ml vzorku nebylo dosaženo lepších mezí stanovitelnosti než při on-line SPE metodě [38].

Závěr

Pro řešení projektu „Čistá voda – zdravé město: Komunální odpadní voda jako diagnostické médium hlavního města Prahy“, ve kterém jsou monitorovány vedle nezákonných drog a jejich metabolitů (včetně syntetických kathinonů) také některá léčiva a další legální drogy, jako jsou ethanol a nikotin, resp. jejich metabolity, byly vypracovány a zvalidovány postupy pro stanovení těchto látek. V závislosti na chemických vlastnostech a možnostech stanovení jednotlivých látek byly o tyto látky rozšířeny již dříve používané metody kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí za podmínek ionizace elektrosprejem v pozitivním módu a v negativním módu. Metody byly akreditovány. Celkem jsou uvedenými metodami stanovovány tři desítky látek. Metody rozvinuté ve VÚV TGM, v. v. i., splňují požadavky na citlivost pro analýzu většiny zneužívaných drog a jejich metabolitů i dalších látek sledovaných v rámci Projektu.